Avidin-peroxidáza

Avidin-peroxidáza (též avidin-peroxidasa) je modifikovaná peroxidáza (nejčastěji získávaná z křenu selského, Armoracia rusticana), na kterou je kovalentně připojen protein avidin (z vaječného bílku).

Peroxidáza je enzym, tzn. patří mezi proteiny; zde znázorněna glutathion peroxidáza

Použití

Mikrofotografie lidských HeLa buněk; tmavé skvrny znázorňují místa, kde se vyskytuje v buňce protein transferin, a to právě pomocí vazby křenové peroxidázy na bílkovinu transferin

Avidin-peroxidáza se velmi často používá v laboratoři k vizualizaci různých biochemických interakcí (protein-proteinových, protein-sacharidových, …), u nichž jeden z účastníků této interakce je modifikován biotinem. Avidin je schopen se specificky a velmi silně vázat na biotin a přes tzv. avidin-biotinový můstek je tedy schopen připojit peroxidasu k interagujícím látkám.

Peroxidáza pak po dodání zdroje peroxidu (H₂O₂, NaBO₃, …) a vhodného substrátu (jenž oxiduje a změní jeho vlastnosti –barva, rozpustnost) vizualizuje tuto interakci. Příkladem vhodných substrátů mohou být 4-chloro-1-naftol - po oxidaci dochází ke vzniku nerozpustné fialové látky – a ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát), který tvoří stabilní, zeleně zbarvené rozpustné radikály.

vzorec ABTS

Avidin peroxidasy se často využívá při metodě ELISA a ELBA metodě a při western blotu. Podobně jako avidin-peroxidasa se však také často využívá kyselá nebo alkalická avidin-fosfatáza.

Stavební částice

Křenová peroxidáza

křenová peroxidáza
alternativní názvy	HRP, horseradish peroxidase
zdroj	křen selský (Armoracia rusticana)
molekulová hmotnost	~44 000^[1]
počet isoenzymů	7^[2]
pI	3-9
pH optimum	6-6,5^[3]
inhibitory	CN⁻, S²⁻, F⁻, N³⁻, Fe³⁺,^[4]

Avidin

biotin

avidin
zdroj	vaječný bílek
molekulová hmotnost	homotetramer, celková Mr = 66-69 000
pI	10,5
biologická funkce	antimikrobiální agents, vyvazuje biotin nutný pro růst bakterii (K_D(avidin-biotin) = 1,10-15M)

Podobně jako avidin se používá i streptavidin - protein o podobných vlastnostech jako avidin (silná a specifická vazba biotinu) izolovaný z Streptomyces avidinii. Na rozdíl od avidinu není streptavidin vůbec glykosylován.

Používané substráty avidin peroxidázy

zkratka	název	rozpustnost produktu
DAB	3,3'diaminobezidin	N
4-CN	4-chloro-1-naftol	N
HYR	Hanker-Yaks reagent	N
AEC	3-amino-9-ethylethanol	N
TMB	3,3',5,5'-tetrametylbenzidin	N
OPD	o-fenylendiamin	R
ABTS	2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát	R

Příprava avidin-peroxidázy

Křenová peroxidáza je kovalentně připojena na avidin pomocí bismaleimidu (dimaleimidu) v poměru přibližně 2:1 (HRP:avidin)^[5]

Odkazy

Reference

↑ Welinder, K.G., Eur. J. Biochem., 96, 483–502 (1978)
↑ Shannon, L.M., et al., J. Biol. Chem., 241, 2166–2172 (1966).
↑ Schomberg, D., Salzmann, M., and Stephan, D., Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6 (1993).
↑ Zollner, H., Handbo]ok of Enzyme Inhibitors, 2nd Ed., Part A: 367–368 (1993).
↑ O'Sullivan MJ, et al, FEBS letters, 35, 311-313 (1978).

Související články

[1] Welinder, K.G., Eur. J. Biochem., 96, 483–502 (1978)

[2] Shannon, L.M., et al., J. Biol. Chem., 241, 2166–2172 (1966).

[3] Schomberg, D., Salzmann, M., and Stephan, D., Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6 (1993).

[4] Zollner, H., Handbo]ok of Enzyme Inhibitors, 2nd Ed., Part A: 367–368 (1993).

[5] O'Sullivan MJ, et al, FEBS letters, 35, 311-313 (1978).

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]