Wikipedie

Cytotoxicita závislá na komplementu

jedna z efektorových funkcí protilátek typu IgG a IgM

Cytotoxicita závislá na komplementu (CDC, complement-dependent cytotoxicity) je jedna z efektorových funkcí protilátek typu IgG a IgM. Na protilátky navázané na povrch cílové buňky (např. bakteriální nebo virem infikované) se může vázat komplementový protein C1q a tím zahájit klasickou cestu aktivace komplementu vedoucí k tvorbě MAC komplexu a lýze buňky.

Dobře aktivují komplement lidské protilátky typu IgG3, IgG1 a IgM, slaběji IgG2, zatímco typ IgG4 komplement neaktivuje vůbec.[1]

CDC je jedním z mechanismů, kterým ničí nádorové buňky terapeutické protilátky nebo rekombinantní fragmenty protilátek.[2][3]

Využití stanovení CDC

editovat

Analýza terapeutických protilátek

editovat

Při vývoji terapeutických protilátek pro léčbu tumorů se testují in vitro efektorové vlastnosti těchto protilátek. V případě testování schopnosti protilátek vyvolat CDC se obvykle inkubují testované protilátky s cílovými buňkami, na které mají působit, a sérem obsahujícím složky komplementu. Poté se určuje, kolik buněk bylo zlyzováno. To lze několika způsoby: 

  • Radioaktivní metoda: cílové buňky jsou předem značené radioaktivním isotopem chromu 51Cr, zlyzováním buněk se chrom uvolní a měří se množství radioaktivity.[4][5]
  • Měření metabolické aktivity živých buněk (barvení živých buněk): k buňkám se po inkubaci s komplementem přidá barvivo (např. calcein-AM[5][6] nebo resazurin[4][7]), které volně projde skrz cytoplazmatickou membránu buňky. Uvnitř živé buňky vznikne pro membránu nepropustný fluorescenční produkt, který lze detekovat průtokovou cytometrií. Mrtvé buňky nejsou metabolicky aktivní, a tudíž v nich ke vzniku produktu nedojde.
  • Měření aktivity uvolněných intracelulárních enzymů: z mrtvých buněk se uvolní enzym (např. laktát dehydrogenáza nebo GAPDH)[4][6], po přidání jeho substrátu dojde k barevné změně, která se měří jako změna absorbance, případně luminiscence.
  • Barvení mrtvých buněk: skrz perforovanou membránu se dovnitř buňky dostane barvivo např. propidium jodid, který se naváže na DNA mrtvé buňky a změří se fluorescenční signál pomocí průtokové cytometrie.[4]

HLA typizace a crossmatch test

editovat

CDC analýza se využívá k nalezení vhodného dárce pro transplantaci orgánů zejména ledvin nebo kostní dřeně, konkrétně pro nalezení dárce se shodným nebo co nejpodobnějším fenotypem histokompatibilního systému HLA.[8] Nejprve se u pacienta a dárců při vstupu do registru provádí typizace HLA (určení, jaký má pacient/dárci fenotyp). Poté se u vhodných dvojic provede crossmatch test (křížová zkouška), aby se vyloučilo, že pacient produkuje donor-specifické anti-HLA protilátky, které by mohly způsobit odhojení štěpu (transplantovaného orgánu).

Při typizace HLA pomocí CDC (sérologická typizace) se využívá soubor anti-HLA protilátek z definovaných antisér (typizační panel). Lymfocyty pacienta nebo dárce se inkubují s jednotlivými anti-HLA protilátkami za přítomnosti komplementu a pomocí barvení živých buněk se určí, jestli a kolik buněk bylo zlyzováno. Dnes už je CDC typizace nahrazována molekulárně genetickou typizací, při které se určují nukleotidové sekvence HLA alel pomocí PCR.[8]

Crossmatch test se standardně provádí pomocí CDC testu. V nejjednodušší variantě se inkubují lymfocyty dárce se sérem pacienta, poté následuje další inkubace po přidání králičího komplementu. Pokud dojde ke zlyzování buněk, test je pozitivní a dárce je vyloučen. Existují modifikace, které zvýší citlivost testu, např. zvýšení doby inkubace, přidání antihumánního globulinu (AHG), vymytí nenavázaných protilátek před přidáním komplementu nebo provedení testu zvlášť pro T lymfocyty a B lymfocyty.[8] Rozšiřuje se také crossmatch test za použití průtokové cytometrie, který je citlivější a odhalí i protilátky, které neaktivují komplement.[9]

Reference

editovat
  1. ↑ SCHROEDER, Harry W.; CAVACINI, Lisa. Structure and function of immunoglobulins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010-2, roč. 125, čís. 2, s. S41–S52. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. DOI 10.1016/j.jaci.2009.09.046. PMID 20176268. (anglicky) 
  2. ↑ MEYER, Saskia; LEUSEN, Jeanette HW; BOROSS, Peter. Regulation of complement and modulation of its activity in monoclonal antibody therapy of cancer. mAbs. 2014-09-03, roč. 6, čís. 5, s. 1133–1144. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. ISSN 1942-0862. DOI 10.4161/mabs.29670. PMID 25517299. (anglicky) 
  3. ↑ WANG, Xinhua; MATHIEU, Mary; BREZSKI, Randall J. IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions. Protein & Cell. 2018-1, roč. 9, čís. 1, s. 63–73. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. ISSN 1674-800X. DOI 10.1007/s13238-017-0473-8. PMID 28986820. (anglicky) 
  4. ↑ a b c d TAYLOR, Ronald P.; LINDORFER, Margaret A. The role of complement in mAb-based therapies of cancer. Methods. 2014-1, roč. 65, čís. 1, s. 18–27. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. DOI 10.1016/j.ymeth.2013.07.027. (anglicky) 
  5. ↑ a b HERNANDEZ, Axel; PARMENTIER, Julie; WANG, Youzhen. Monoclonal Antibody Lead Characterization: In Vitro and In Vivo Methods. Příprava vydání Patrick Chames. Svazek 907. Totowa, NJ: Humana Press Dostupné online. ISBN 9781617799730, ISBN 9781617799747. DOI 10.1007/978-1-61779-974-7_32. S. 557–594. (anglicky) DOI: 10.1007/978-1-61779-974-7_32. 
  6. ↑ a b GILLISSEN, M. A.; YASUDA, E.; DE JONG, G. The modified FACS calcein AM retention assay: A high throughput flow cytometer based method to measure cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 2016-07-01, roč. 434, s. 16–23. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. ISSN 0022-1759. DOI 10.1016/j.jim.2016.04.002. 
  7. ↑ GAZZANO-SANTORO, H.; RALPH, P.; RYSKAMP, T. C. A non-radioactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20 monoclonal antibody. Journal of Immunological Methods. 1997-03-28, roč. 202, čís. 2, s. 163–171. PMID 9107305. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. ISSN 0022-1759. DOI 10.1016/s0022-1759(97)00002-1. PMID 9107305. 
  8. ↑ a b c GAUTREAUX, Michael D. Chapter 17 - Histocompatibility Testing in the Transplant Setting. Příprava vydání Giuseppe Orlando, Giuseppe Remuzzi, David F. Williams. [s.l.]: Academic Press Dostupné online. ISBN 9780128017340. S. 223–234. DOI: 10.1016/B978-0-12-801734-0.00017-5. 
  9. ↑ GUILLAUME, Nicolas. Improved flow cytometry crossmatching in kidney transplantation. HLA. 2018-12, roč. 92, čís. 6, s. 375–383. Dostupné online [cit. 2019-08-30]. DOI 10.1111/tan.13403. (anglicky) 
Citováno z „https://cs.wikipedia.org/w/index.php?title=Cytotoxicita_závislá_na_komplementu&oldid=21241160“